目的:探讨大电导钙依赖性钾通道（BKCa）参与脓毒症发病的机制。方法:收集脓毒症患者（28例）、普通感染者（25例）和健康体检者（25例）血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定BKCa水平；并分析脓毒症患者血清BKCa水平与急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ（APACHEⅡ）的相关性。培养RAW 264.7细胞，用脂多糖（LPS）刺激，部分实验以尼日尼亚菌素（Nigericin）作为第二刺激信号构建脓毒症细胞模型；采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）测定不同浓度LPS（0、50、100、1 000 μg/L）刺激后细胞BKCa的mRNA和蛋白表达。RAW 264.7细胞转染BKCa的小干扰RNA（siRNA-BKCa），用Western blotting测定细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1前体（pro-caspase-1）、白细胞介素-1β前体（pro-IL-1β），细胞培养液中caspase-1 p20、IL-1β p17，以及NOD样受体蛋白3（NLRP3）、核转录因子-κB（NF-κB）水平。碘化丙啶（PI）染色后荧光显微镜下观察凋亡情况，测定乳酸脱氢酶（LDH）释放率，Western blotting测定细胞凋亡蛋白Gasdermin D（GSDMD）表达以评估沉默BKCa对细胞焦亡的影响。结果:脓毒症患者血清BKCa明显高于普通感染者和健康体检者（ng/L：165.2±25.9比102.5±25.9、98.8±20.0，均 P<0.05），且脓毒症患者血清BKCa水平与APACHEⅡ评分呈显著正相关（ r＝0.453， P＝0.013）。用LPS构建脓毒症细胞模型，显示LPS呈浓度依赖地促进BKCα的mRNA和蛋白表达，1 000 μg/L刺激后细胞BKCa的mRNA和蛋白表达水平均较空白组（0 μg/L）明显增加〔BKCa mRNA（2 -ΔΔCt）：3.00±0.36比1.00±0.16，BKCa/β-actin：1.30±0.16比0.37±0.09，均 P<0.05〕。与对照组比较，模型组细胞caspase-1 p20/pro-caspase-1比值、IL-1βp17/pro-IL-1β比值均明显升高（caspase-1 p20/pro-caspase-1比值：0.83±0.12比0.27±0.05，IL-1βp17/pro-IL-1β比值：0.77±0.12比0.23±0.12，均 P<0.05）；但转染siRNA-BKCa后二者均较模型组明显下降（caspase-1 p20/pro-caspase-1比值：0.23±0.12比0.83±0.12，IL-1βp17/pro-IL-1β比值：0.13±0.05比0.77±0.12，均 P<0.05）。与对照组比较，镜下观察模型组凋亡细胞明显增多，LDH释放率、GSDMD表达明显增加〔LDH释放率：（30.60±8.40）%比（15.20±7.10）%，GSDMD-N/GSDMD-FL：2.10±0.16比1.00±0.16，均 P<0.05〕；但转染siRNA-BKCa后上述指标均较模型组明显下降〔LDH释放率：（15.60±7.30）%比（30.60±8.40）%，GSDMD-N/GSDMD-FL：1.13±0.17比2.10±0.16，均 P<0.05〕。脓毒症细胞NLRP3的mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显增加〔NLRP3 mRNA（2 -ΔΔCt）：2.06±0.17比1.00±0.24，NLRP3/GAPDH：0.46±0.05比0.15±0.04，均 P<0.05〕；但转染siRNA-BKCa后NLRP3表达较模型组明显下降〔NLRP3 mRNA（2 -ΔΔCt）：1.57±0.09比2.06±0.17，NLRP3/GAPDH：0.19±0.02比0.46±0.05，均 P<0.05〕。与对照组比较，脓毒症细胞NF-κB p65核转移明显增加（NF-κB p65/Histone：0.73±0.12比0.23±0.09， P<0.05）；而转染siRNA-BKCa后细胞核中NF-κB p65表达明显下降（NF-κB p65/Histone：0.20±0.03比0.73±0.12， P<0.05）。 结论:BKCa参与脓毒症发病，其可能机制是激活NF-κB/NLRP3/caspase-1信号通路诱导炎症因子生成和细胞焦亡。

大电导钙激活钾离子通道是一种具有钙离子敏感性及电压依赖性且对血管张力调节具有重要作用的膜离子通道，糖尿病时血管平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道结构及功能发生改变，说明糖尿病血管病变可能与大电导钙激活钾离子通道异常有关。活性氧是体内一类氧的单电子还原产物，高血糖状态下活性氧生成增加。目前越来越多的证据表明高血糖状态下活性氧影响大电导钙激活钾离子通道功能，但具体机制尚不完全清楚。本文主要综述活性氧对糖尿病血管平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道的影响及其机制。

目的 探讨褪黑素(MT)在诱导血管舒张过程中对大电导钙激活钾通道(BKca通道)的直接作用机制.方法 选用8周龄雄性Wistar大鼠,麻醉后取肠系膜动脉,分别采用微血管张力测定和单通道膜片钳技术检测褪黑素及其受体对血管张力和血管平滑肌细胞BKca通道门控特性的影响.结果 (1)褪黑素本身对血管张力没有显著影响,但是可引起去甲肾上腺素(NE)激动的肠系膜动脉呈浓度依赖性舒张,这种舒张作用可以被褪黑素受体MT1/MT2阻断剂2-苯基-N-乙酰色胺(Luz)和BKca通道特异性阻断剂iberiotoxin (IbTX)不同程度地抑制,其中IbTX抑制作用更显著.(2)单通道膜片钳贴附式结果显示,褪黑素可引起肠系膜动脉平滑肌细胞BKca通道的开放概率、平均开放时间显著增加,平均关闭时间显著降低;Luz可显著抑制褪黑素对BKca通道的激活作用.(3)单通道膜片钳内面向外模式结果同样显示,褪黑素可引起BKca通道的开放概率、平均开放时间显著增加,平均关闭时间显著降低.结论 褪黑素可诱发肠系膜动脉血管舒张,其中,褪黑素直接或通过受体作用间接激活平滑肌细胞BKca通道可能是其作用机制之一.

目的 评价瑞芬太尼对正常和高血压大鼠基底动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道(BKCa)和电压门控钾通道(Kv)激活电流的影响.方法 自发性高血压大鼠(spontaneously hy-pertensive rats,SHR)和同源正常血压(wistar-kyoto,WKY)大鼠,采用酶消化法急性分离基底动脉平滑肌细胞,每种大鼠选择6个基底动脉平滑肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录外向电流幅度.加入瑞芬太尼3×10-7mol/L,分别记录所设置的方波刺激(step刺激)方案中所有刺激电压下给药前(基础水平)和给药后电流幅度,并计算净电流=给药后电流幅度-基础值;采用浓度累积法给药,分别记录+60 mV刺激电压下给药前(基础值)和给予10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 瑞芬太尼后电流幅度,计算电流增加率和瑞芬太尼增加基底动脉平滑肌细胞电流幅度的半数有效浓度(EC50);另取每种大鼠6个基底动脉平滑肌细胞,加入瑞芬太尼3×10-7mol/L后分别给予 BKCa阻滞剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)和Kv阻滞剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP),再分别加入其相应的瑞芬太尼混合液,记录每一次给药后的电流幅度.结果 两种大鼠基底动脉平滑肌细胞给瑞芬太尼后在0、+20、+40和+60 mV 刺激电压下产生的净电流依次明显增大(P<0.05);10-10、10-9、10-8、10-7mol/L瑞芬太尼作用下,两种大鼠基底动脉平滑肌细胞外向电流增加率依次明显升高(P<0.05);与 WKY大鼠比较,瑞芬太尼增加 SHR基底动脉平滑肌细胞电流幅度的(EC50)明显升高(P<0.05);与基础值比较,两种大鼠基底动脉平滑肌细胞瑞芬太尼给药后电流幅度明显升高,TEA给药后或4-AP给药后电流幅度明显降低(P<0.05);与 TEA 给药后或4-AP给药后比较,TEA+瑞芬太尼给药后或4-AP+瑞芬太尼给药后两种大鼠基底动脉平滑肌细胞电流幅度明显升高(P<0.05).结论 瑞芬太尼呈电压依赖性和浓度依赖性激活两种大鼠基底动脉平滑肌细胞BKCa和Kv电流,瑞芬太尼对 SHR基底动脉平滑肌细胞上BKCa和 Kv激活电流的作用较WKY大鼠弱.

人体时刻都在维持机体的电解质稳态,而肾脏是机体保持钾离子均衡的主要器官,肾脏中参与钾离子代谢的通道主要有肾外髓钾通道(renal outer medullary K channel,ROMK)和大电导钙离子依赖性钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BK).近些年的研究已经证实了ROMK通道负责基础的钾离子分泌,而BK通道则发挥补充作用,尤其是在Batter综合征和Gitleman综合征两种基因紊乱疾病中作用显著.BK通道分布于神经元,心肌细胞,各脉管系统等多种细胞上.本文则主要阐述BK通道在肾脏中的分布、类型、功能、调控方式等方面的研究.

目的 探讨钙调磷酸酶/活化T细胞因子(CaN/NFAT)信号通路在有氧运动诱导原发性高血压大鼠(SHR)肠系膜动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾通道(KV2.1)表达上调中的作用.方法 选用3月龄雄性WKY和SHR大鼠各24只,随机分为WKY安静组和运动组(WKY-SED组、WKY-EX纽)、SHR安静组和运动组(SHR-SED组、SHR-EX组).运动干预前和12周运动结束后分别测量大鼠安静状态下的心率和血压.分别采用免疫组化和Western blot检测KV2.1、CaN在肠系膜动脉的分布以及KV2.1、CaN、p-NFATc3、A型激酶锚定蛋白(AKAP150)和钙调蛋白(CaM)的蛋白表达.结果 (1)12周有氧运动后,与SHR-SED组相比,SHR-EX组心率、收缩压和平均动脉压均显著降低(P＜0.01);与WKY-SED组相比,WKY-EX组收缩压显著降低(P＜0.05).(2)与WKY-SED组相比,SHR-SED组KV2.1在肠系膜动脉的蛋白表达显著减少(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组KV2.1的蛋白表达显著增加(p＜0.01).(3)与WKY-SED组相比,SHR-SED组CaN在肠系膜动脉的蛋白表达显著增加(P＜0.01),p-NFATc3的蛋白表达显著减少(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组CaN的蛋白表达显著减少(P＜0.01),p-NFATc3的蛋白表达显著增加(P＜0.01).(4)与WKY-SED组相比,SHR-SED组的AKAP150蛋白表达显著增加(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组的AKAP150蛋白表达显著减少(P＜0.01).(5)与WKY-SED组相比,SHR-SED组的CaM蛋白表达显著增加(P＜0.01);与SHR-SED组相比,SHR-EX组的CaM蛋白表达显著减少(P＜0.01);相比WKY-SED组,WKY-EX组CaM的蛋白表达量显著升高(P＜0.05).结论 钙调磷酸酶/活化T细胞核因子信号通路表达上调是高血压引起KV2.1通道功能下降的重要原因,有氧运动可以有效抑制这种作用,这可能是有氧运动缓解高血压及重塑血管功能的机制之一.

线粒体由内外两层膜封闭而成,其中线粒体内膜作用极为重要,呼吸链蛋白复合体附着于线粒体内膜,同时于此完成其生理功能.目前,线粒体内膜已鉴定出多种钾离子通道蛋白,如线粒体选择性钾离子通道,包括ATP依赖钾通道(mitoKATP)、电压依赖性钾通道(mitoKv 1.3)、小电导钙离子激活钾通道(mitoSKCa)、中电导钙离子激活钾通道(mitoIKCa)、大电导钙离子激活钾通道(mitoBKQ)、pH依赖钾离子通道(mitopH-sensitive K+ channels)以及TASK-3双孔钾通道(mitoTASK-3)[1-2].其中,Xu等[3]于2002年首次发现mitoBKCa在心血管疾病中扮演着极为重要的角色.随着对mitoBKCa研究的深入,发现mitoBKCa在细胞凋亡等多种生理、病理活动中也起着重要作用[4].笔者对mitoBKCa结构与功能研究的进展进行一个简要总结.

目的 探讨WNK3激酶对肾脏大电导钙激活钾通道(Maxi K通道)的调节作用及其机制.方法 (1)在非洲绿猴肾成纤维细胞(Cos-7细胞)中转染0.5 μg Maxi K质粒的同时分别转染0、0.6、1.2、1.8 μg WNK3质粒,Western印迹检测细胞总蛋白中Maxi K通道的表达及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)的磷酸化水平.(2) Cos-7细胞分为转染2.5 μg Maxi K质粒组(对照组)和转染2.5 μg Maxi K质粒+2.5 μg WNK3质粒组(实验组),细胞表面生物素化方法检测细胞表面膜蛋白中Maxi K通道的表达,免疫沉淀和Western印迹检测Maxi K通道蛋白泛素化水平.(3)用WNK3 siRNA沉默WNK3激酶基因,用质子泵抑制剂(Baf-A1)阻断溶酶体降解途径,Cos-7细胞分为Maxi K+阴性对照siRNA组、MaxiK+WNK3 siRNA组和Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1组.Western印迹检测细胞中Maxi K通道蛋白的表达.结果 (1)与0 μg WNK3质粒组比较,转染0.6、1.2、1.8 μg WNK3质粒组细胞总蛋白中Maxi K通道的表达均升高,MAPK ERK1/2的磷酸化水平均降低(均P＜0.01),且呈剂量依赖性.(2)与对照组比较,同时转染WNK3和Maxi K的实验组细胞总蛋白和膜蛋白中Maxi K通道的表达均增加,Maxi K通道蛋白的泛素化水平降低(均P＜0.01).(3)与Maxi K+阴性对照siRNA组比较,Maxi K+WNK3 siRNA组Maxi K蛋白表达降低(P＜0.01),Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1组的Maxi K蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与Maxi K+WNK3 siRNA组比较,Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1组的Maxi K蛋白表达升高(P＜0.01).结论 WNK3激酶通过减少MaxiK通道蛋白的泛素化来抑制Maxi K通道的溶酶体降解途径,从而促进Maxi K通道在细胞内和细胞膜上的表达量.其机制可能与MAPK ERK1/2转导通路有关.

目的:探究慢性心衰大鼠下丘脑室旁核(PVN)内花生四烯酰乙醇胺(AEA)对心脏功能和交感神经活动的影响.方法:采用冠状动脉结扎法构建大鼠心衰模型,超声心动图检测心功能;PVN内连续4周分别灌注AEA、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)选择性抑制剂KN-93、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道特异性阻断剂辣椒平(CPZ)、Ca2+螯合剂BAPTA-AM和小电导钙激活钾通道(SK通道)阻断剂apamin后,检测交感驱动及心功能指标;同时采用不同浓度AEA孵育NG108细胞,荧光测定法检测细胞内钙离子浓度([Ca2+]i);Western blot检测CaMKII、SK2及磷酸化TRPV1蛋白水平.结果:与假手术组相比,心衰组左心室舒张末期压(LV-EDP)明显升高,左室压力最大上升、下降速率(±dp/dtmax)和射血分数(EF)明显下降;PVN内AEA含量、[Ca2+]i及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平均显著降低;与溶剂组相比,心衰组PVN内灌注AEA可显著降低心衰大鼠死亡率和交感驱动指标,并改善心功能;然而,PVN内分别灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin均显著增强交感驱动指标并恶化心功能;AEA可剂量依赖性增加NG108细胞内[Ca2+]i及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平.结论:室旁核内CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信号通路可能参与了AEA对心衰大鼠心脏功能和交感神经活动的影响.

大动脉血管平滑肌细胞膜上存在许多大电导钙激活钾(BKCa)通道,其在维持细胞正常生理活动及血管舒缩功能中起重要作用.研究发现,当细胞膜去极化和(或)细胞内钙离子浓度增加时可激活BKCa通道,使其开放,细胞内钾离子外流增加,导致细胞膜超极化,阻断电压依赖性钙通道,钙离子内流减少,引起血管平滑肌舒张.在高血压、糖尿病、尿毒症、缺氧、心力衰竭和老化等许多生理、病理情况下,BKCa通道结构、功能及门控特性发生改变,从而影响其正常生理功能以及对血管舒缩功能的调节.本文主要综述近年来BKCa通道在大动脉血管平滑肌细胞舒缩调节机制中的研究进展.