目的 基于生物信息学方法筛选调控Rab23表达以及影响头颈部鳞状细胞癌预后相关的MicroiRNA(miRNA)并验证,为进一步探讨头颈部鳞状细胞癌的发生和侵袭作用机制提供新的研究思路和方法.方法 依据miRWalk数据库筛选调控Rab23表达的潜在miRNA,根据TCGA公共数据库和miRWalk数据库筛选影响头颈部鳞状细胞癌生存期的差异表达miRNA,双重筛选交集后确定调控Rab23表达及影响头颈部鳞状细胞癌预后相关的miRNA分子,再通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹和双荧光素酶实验进行结果验证.结果 筛选出250个差异表达miRNA,其中8个是潜在调控Rab23表达的miRNA.hsa-miR-363-3p是既能调控Rab23表达,又可显著影响头颈部鳞状细胞癌预后的miRNA.RT-qPCR、蛋白免疫印迹实验证实hsa-miR-363-3p与Rab23在肿瘤细胞和转染细胞模型中呈负调控;双荧光素酶实验验证hsa-miR-363-3p能够靶向作用于Rab23基因.结论 hsa-miR-363-3p参与靶向调控Rab23表达,可能参与了头颈部鳞状细胞癌的侵袭和转移的作用机制.

目的:沉默调节蛋白家族(sirtuins,SIRT)是一类以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为辅酶的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶.YME1样三磷酸腺苷酶(YME1 like 1 ATPase,YME1L1)对于维持线粒体形态、功能和可塑性至关重要.视神经萎缩相关蛋白 1(optic atrophy 1,OPA1)主要介导线粒体融合.本研究拟探索乳腺癌内分泌治疗耐药中SIRT3的表达变化,SIRT3与YME1L1、OPA1之间的关系及在乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用机制.方法:使用4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)诱导耐他莫昔芬(tamoxifen,TAM)的MCF-7/TAM.采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力,验证耐药性.采用透射电镜和免疫荧光染色(immunofluorescence staining,IF)实验观察线粒体形态.通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测SIRT3、OPA1的基因表达和蛋白水平.采用JC-1染色检测线粒体膜电位,采用二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)染色检测活性氧,验证线粒体功能.采用RNA干扰技术在耐药细胞中敲低SIRT3,采用过表达质粒在亲本细胞中过表达SIRT3及YME1L1基因野生型(wild type,WT)、模拟乙酰化状态突变型(mutant,MUT K237Q)、模拟去乙酰化状态突变型(MUT K237R).采用免疫沉淀技术(immunoprecipitation assay,IP)及IF分析SIRT3与YME1L1之间的相互作用.结果:RTFQ-PCR及Western blot检测结果显示,SIRT3在耐药细胞中的表达显著高于亲本细胞.在亲本细胞中过表达SIRT3,乳腺癌细胞对TAM的敏感性出现下降.在耐药细胞中敲低SIRT3,耐药细胞对TAM的敏感性增强.DHE染色结果显示,在相同浓度的TAM处理下,耐药细胞中ROS水平低于亲本细胞;透射电镜及IF结果显示,相较于亲本细胞,耐药细胞的线粒体伸长;Western blot检测结果显示,耐药细胞L-OPA1蛋白表达水平高于亲本细胞.在亲本细胞中过表达SIRT3,线粒体功能增强,其形态较对照组更长;此外,L-OPA1表达上调;而在耐药细胞中敲低SIRT3后,得到相反结果.为了进一步验证SIRT3如何调控OPA1蛋白,影响线粒体的形态及功能,促进乳腺癌耐药,我们在亲本细胞中过表达YME1L1(野生型及突变型质粒),结果显示,过表达模拟去乙酰化状态的YME1L1与过表达SIRT3结果相似,过表达乙酰化状态的YME1L1得到与敲低SIRT3相似的结果.IP实验证实,SIRT3与YME1L1在乳腺癌细胞中存在相互作用;在SIRT3不同表达水平下,YME1L1乙酰化水平不同.IF实验显示,在MCF-7细胞中YME1L1与SIRT3存在共定位.结论:SIRT3在耐TAM的乳腺癌细胞中高表达.SIRT3通过去乙酰化YME1L1上调L-OPA1表达,进而促使线粒体融合并增强线粒体功能,促进乳腺癌对TAM耐药.

目的 探索流体剪应力对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达的影响.方法 以HUVECs作为实验细胞,设计并构建流体动力学模拟实验系统,控制流体动力学模拟实验系统中灌流液的流速,以实现对实验细胞施加不同的流体剪应力.按实验细胞在实验系统中所承受的不同流体剪应力,将实验细胞分为低剪应力组(A组;0.4 Pa)、中剪应力组(B组;0.8 Pa)和高剪应力组(C组;1.2 Pa).每组HUVECs包含3个细胞玻片,每个玻片经实验系统灌流液反复循环流经12 h.采用蛋白质印迹法对各组细胞中GRP78和CHOP蛋白水平进行检测,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术测定各组细胞GRP78和CHOP蛋白及其信使RNA(mRNA)相对水平.应用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析.结果(1)A、B、C组HUVECs中GRP78蛋白相对表达水平分别为1.33±0.46、0.93±0.34、0.64±0.30;多组间比较差异有统计学意义(F=36.17,P＜0.05).A组GRP78蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P＜0.01),B组GRP78蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0013).3组HUVECs中CHOP蛋白相对表达水平分别为:A组1.29±0.38,B组0.90±0.34,C组0.59±0.29;多组间比较差异有统计学意义(F=41.27,P＜0.05).A组CHOP蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P＜0.01),B组CHOP蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0 004).(2)A、B、C组HUVECs中GRP78 mRNA相对表达水平分别为18.3±3.4、11.3±1.8、5.4±2.2;多组间比较差异有统计学意义(F=189.20,P＜0.05).A 组 GRP78 mRNA 相对表达水平高于 B 组、C 组(均 P＜0.01),B 组 GRP78 mRNA相对表达水平高于C组(P＜0.01).3组HUVECs中CHOP mRNA相对表达水平分别为:A组20.4±3.8,B组14.2±2.1,C组7.8±1.3;多组间比较差异有统计学意义(F=171.80,P＜0.05).A组CHOP mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P＜0.01),B组CHOP mRNA相对表达水平高于C组(P＜0.01).结论 低流体剪应力可能增加HUVECs中GRP78、CHOP的蛋白及其mRNA表达水平.

背景与目的:结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是一种常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率仅次于胃癌和食管癌,在消化系统恶性肿瘤中居第二位.越来越多的证据表明,免疫细胞在CRC的发生、发展中发挥着重要作用.本研究旨在构建一个与免疫细胞相关的基因的预后模型,以预测CRC患者的预后并进行精准管理.方法:从基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库和癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载结直肠癌的单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)和普通转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据以及临床信息,提取免疫细胞亚型的差异基因,通过Cox回归和LASSO回归分析在TCGA数据中筛选出与预后相关的基因,同时使用GSE39582和GSE41258进行外部验证.基于预后模型进行化疗药物敏感性分析、免疫治疗效果分析、风险评分相关的通路分析以及临床相关性分析.采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和免疫组织化学检测验证模型基因在10例经术后病理学检查的新鲜冷冻结直肠癌样本和细胞系中的表达水平,样本采集均已获得复旦大学附属肿瘤manbet官网登录 伦理委员会的批准(伦理编号:050432-4-2108*).结果:本研究根据scRNA-seq数据集(GSE161277)定义了16个细胞群,并通过R包celldex将这些群标记为不同的细胞类型.然后对免疫细胞亚型进行差异分析,共获得了374个差异表达基因.通过单因素Cox和LASSO回归分析,本研究在CRC中构建了一个9基因风险预后模型.该风险模型表现出对预后的可靠预测效果,对预测抗肿瘤药物敏感性、免疫治疗效果、潜在分子机制及临床特征等方面起重要作用,高风险分数的患者从免疫疗法中受益概率较低.结论:我们基于CRC肿瘤微环境中免疫细胞的异质性构建了一个包含9个基因的风险预后模型,并据此预测了CRC患者的生存和治疗效果.

[目的]了解2018-2023年上海市普陀区儿童感染性腹泻病的病原谱和分子特征,为儿童感染性腹泻防控提供科学依据.[方法]收集2018年1月—2023年12月上海市普陀区儿童腹泻病监测哨点manbet官网登录 就诊病例的粪便标本,通过分离培养11种细菌和实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测5种病毒.使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准分型法分析部分阳性菌株的分子分型;采用逆转录PCR方法扩增部分诺如病毒阳性标本的聚合酶-衣壳蛋白连接区,基因测序后使用生物信息软件进行分析.采用χ2检验或Fisher精确概率法比较2018-2019年和2020-2023年病原体阳性率.[结果]707例病例中,总阳性率为47.67%,单一细菌阳性率为16.27%,单一病毒阳性率为22.63%,混合阳性率为8.77%.优势病原体为轮状病毒(10.75%)、诺如病毒(10.33%)、肠致病性大肠杆菌(8.06%)、沙门菌(6.36%)、肠集聚性黏附大肠杆菌(5.52%)、弯曲菌(5.23%).夏秋季以细菌感染为主,冬春季以病毒感染为主.2020-2023年的总阳性率较2018-2019年下降(χ2=5.753,P<0.05).对37株沙门菌、81株肠致泻性大肠杆菌、19株弯曲菌完成PFGE分子分型分析,分别分为28种、80种和18种带型,带型相似度范围较广.19份诺如病毒经GⅡ组基因序列分析分为5种基因型,主要为GⅡ.Pe-GⅡ.4型和GⅡ.P16-GⅡ.2型.[结论]轮状病毒、诺如病毒、肠致泻性大肠埃希菌、沙门菌、弯曲菌为上海市普陀区儿童感染性腹泻的优势病原体,病原谱呈现季节性流行特征,部分病原体的分子特征存在多样性.应在不同季节加强儿童感染性腹泻病原体的分子特征监测,为防控提供实验室依据.

目的 探究性别决定区Y框蛋白4(SOX4)通过靶向调节微小RNA(miR)-17表达水平对结直肠癌细胞免疫逃逸及细胞迁移的影响.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应检测正常结直肠黏膜上皮细胞及4种结直肠癌细胞中SOX4、miR-17表达水平.取结直肠癌细胞将其分为结直肠癌细胞(CC)组、结直肠癌细胞+SOX4-NC(SN)组、结直肠癌细胞+SOX4激动剂(SM)组、结直肠癌细胞+SOX4抑制剂(SI)组、结直肠癌细胞+miR-17-NC(MN)组、结直肠癌细胞+miR-17激动剂(MM)组、结直肠癌细胞+miR-17抑制剂(MI)组、结直肠癌细胞+SOX4抑制剂+miR-17抑制剂(Ⅱ)组.采用免疫印迹法检测程序性死亡受体-1(PD-1)及PD-1配体(PD-L1)表达水平,小室法检测细胞迁移数量,双荧光素酶报告基因检测各组细胞荧光素酶活性.结果 4种结直肠癌细胞中SOX4、miR-17 mRNA表达水平明显高于FHC正常结直肠黏膜上皮细胞,差异均有统计学意义(P＜0.05).CC组与SN组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).SM组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量均明显高于SN组,SI组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量均明显低于SM组,差异均有统计学意义(P＜0.05).CC组与MN组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).MM组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量均明显高于MN组,MI组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量均明显低于MM组,差异均有统计学意义(P＜0.05).SI组与MI组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).Ⅱ组PD-1、PD-L1蛋白表达水平及细胞迁移数量均明显低于MI组,差异均有统计学意义(P＜0.05).双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染SOX4后miR-17-3'-UTR-WT的荧光素酶活性明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),miR-17-3'-UTR-MUT的荧光酶活性无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 抑制SOX4表达水平可有效抑制结直肠癌细胞免疫逃逸,并抑制细胞迁移,其作用机制可能与抑制miR-17表达水平有关.

目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME)在新生大鼠缺氧性肺动脉高压中的保护作用.方法 96只Wistar新生大鼠随机分为常氧组、缺氧组和缺氧+2ME组,每组随机分为3 d、7 d、14 d、21 d亚组,每个亚组8只.缺氧组和缺氧+2ME组分别予以每日皮下注射生理盐水和2ME(剂量240 μg/kg),常氧组在常氧环境下饲养,每日皮下注射生理盐水.直接测压法测量右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP);苏木精-伊红染色观察肺血管形态,计算肺血管重塑指标肺小动脉中层血管壁厚度占血管外径的百分比(MT%)和肺小动脉中层截面积占血管总截面积的百分比(MA%);免疫组化法检测肺组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测HIF-1α、PCNA mRNA表达水平.结果 与常氧组比较,缺氧3、7、14、21 d时缺氧组、缺氧+2ME组RVSP升高,HIF-1α、PCNA蛋白和mRNA表达水平上调(P<0.05),缺氧7、14、21 d时缺氧组MT%、MA%增加(P<0.05);与缺氧组比较,缺氧3、7、14、21 d时缺氧+2ME组RVSP降低,HIF-1α、PCNA蛋白和PCNA mRNA表达水平下调(P<0.05),缺氧7、14、21 d时缺氧+2ME组MT%、MA%减少(P<0.05).结论 2ME可能通过抑制HIF-1α、PCNA表达,减轻肺血管重塑,对新生大鼠缺氧性肺动脉高压发挥保护作用.

目的 探究植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中对目标核酸的保护效果.方法 分别提取绿萝、水稻、竹子3种常见植物中的RNA作为载体RNA,同时以商业试剂Takara载体RNA为对照,提取甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSV A)核酸,并利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)定量分析提取得到的病毒核酸浓度,以评估植物RNA在核酸提取中对病毒核酸的保护效果.结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,所提取植物RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰明亮,无弥散现象,所得RNA具有良好的完整性.且经验证,植物RNA对病毒核酸扩增无干扰.裂解液中分别加入0、1000、3000、5 000、7 000、9 000 ng绿萝RNA进行Flu A RNA提取时,提取物经RT-qPCR扩增后的Ct值分别为 35.06±0.14、33.01±0.42、32.45±0.33、31.95±0.34、31.74±0.28、31.92±0.24,使用 Takara 载体RNA提取核酸的Ct值为31.96±0.34.Ct值随着绿萝RNA添加量增加而降低,当添加量≥5 000 ng时,Ct值接近使用Takara载体RNA的提取组,继续提高绿萝RNA用量,Ct值趋于稳定,且与使用TaKaRa载体RNA的Ct值比较,差异无统计学意义(P＞0.05).添加5 000 ng绿萝RNA与添加0 ng绿萝RNA相比,Ct值相差3.11,根据浓度差等于2△Ct计算可知添加5 000 ng绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加载体RNA高了 8.63倍.进一步研究发现,添加绿萝RNA、水稻RNA、竹子RNA及Takara载体RNA,提取得到的Flu A、Flu B和RSV A核酸经RT-qPCR扩增后得到的Ct值与不添加载体RNA比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).绿萝RNA作为载体RNA在提取Flu A、Flu B、RSV A混合病毒核酸时,对比无载体RNA的对照组,分别降低了 2.61、2.90、1.45个Ct值,即添加了绿萝RNA后提取Flu A、FluB、RSV A所得的核酸浓度分别提高了 6.11、7.46、2.73倍.且添加了水稻RNA和竹子RNA提取混合病毒核酸所得的核酸浓度也分别至少提高了 2.63倍和2.60倍.结论 在病毒核酸提取过程中植物RNA具有保护病毒核酸的作用,可以提高提取得到的目的病毒RNA浓度,可用作病毒核酸提取时的载体RNA,为核酸提取中的载体RNA选择提供更多来源.

目的 探讨上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在大鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型中的作用及机制.方法 实验分为两部分.(1)将48只早产大鼠随机分为常氧组和高氧组,每组24只.高氧组暴露于85%氧气中建立早产大鼠BPD模型,常氧组置于同一室内常压空气中,于实验第1、4、7、14天收集早产大鼠肺组织标本.(2)将大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系(RLE-6TN)随机分为常氧组(常规空气中培养)和高氧组(在95%氧气中培养),分别于高氧暴露后12 h、24 h、48 h收集细胞标本进行检测.使用苏木精-伊红染色法观察早产大鼠肺泡化情况,免疫荧光检测早产大鼠肺组织和RLE-6TN细胞肺表面活性蛋白C(surfactant protein C,SPC)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的共定位.实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测早产大鼠肺组织和RLE-6TN细胞EMT相关mRNA和蛋白表达水平.结果 (1)与常氧组相比,高氧暴露7 d开始高氧组早产鼠可见肺泡化阻滞和肺泡结构简单化改变;肺组织中SPC和α-SMA存在明显共定位现象,高氧暴露7 d、14 d时,与常氧组比较,高氧组SPC表达减少,α-SMA表达增加;高氧暴露7 d、14 d时,与常氧组比较,高氧组TGF-β1、α-SMA、N-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),SPC、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05).(2)高氧暴露24 h、48 h时,与常氧组比较,高氧组SPC表达减少,α-SMA表达增加;高氧暴露48 h时,与常氧组比较,高氧组SPC、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),TGF-β1、α-SMA、N-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达升高(P<0.05).结论 EMT破坏了BPD早产大鼠肺泡上皮细胞之间的紧密连接,造成肺泡结构简单化和发育异常,参与了BPD的发生发展.

目的 探讨 C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白 6(C1q/tumour necrosis factor-related protein 6,CTRP6)对阿霉素(doxoru-bicin,DOX)诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的影响及其相关作用机制.方法 建立H9C2心肌细胞损伤模型,设置对照组(NS 组)、DOX(1μmol/L)组和 DOX(1 μmol/L)+浓度梯度 CTRP6 组(CTRP6 浓度分别为 0.5、1、3、5μg/ml),培养 24h 后检测心肌细胞生存率,结果表明,CTRP6浓度为3μg/ml时,心肌细胞的生存率提高最显著,因此后续实验CTRP6浓度选择3μg/ml.后续H9C2心肌细胞实验分组为对照组(NS组)、CTRP6组、DOX(1 μmol/L)组和DOX(1 μmol/L)+CTRP6(3μg/ml)组.荧光实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和 Western blot 法检测 DOX 刺激后 CTRP6 转录及翻译水平改变,Tunel法检测细胞凋亡水平,使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测细胞谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondi-aldehyde,MDA)含量,Western blot法检测脂联素受体1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)蛋白水平改变,检测蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3(protein kinase B/glycogen synthase kinase-3β,Akt/GSK-3β)信号通路蛋白表达改变情况.结果 与对照组(NC组)比较,DOX组细胞CTRP6蛋白表达水平及mRNA水平显著降低(分别降低46.26％及67.74％,P＜0.05);与DOX组比较,DOX+CTRP6组CTRP6蛋白表达水平显著提高(P＜0.05);加入不同浓度梯度的CTRP6蛋白,其中DOX+3μg/ml CTRP6处理组心肌细胞存活率显著提高了 26.48％(P＜0.05);Tunel染色显示凋亡减少,Bcl-2表达升高;抗氧化分子GSH-Px及SOD活性分别升高20.49％及36.89％,MDA水平受到显著抑制(降低47.09％,P＜0.05);AdipoR1蛋白水平显著提高(P＜0.05);Akt/GSK-3β信号通路蛋白磷酸化水平显著升高.结论 CTRP6改善DOX诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤,可能是通过Akt/GSK-3β信号通路发挥的保护作用.