目的:探讨转录因子En1在食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞中的功能及机制。方法:利用癌症基因组图谱数据库（TCGA）中9 397例泛癌患者的En1表达和总生存资料、4 349例泛癌患者的En1表达和无进展生存资料，分析泛癌中En1表达水平与患者预后的关系。利用基因表达综合数据库（GEO）的53对和国家基因组科学数据中心-组学原始数据归档库（NGDC-GSA）的155对ESCC组织和配对癌旁组织的基因表达资料分析ESCC组织中En1的表达水平。以慢病毒系统介导ESCC细胞KYSE180和KYSE450中En1基因敲降，采用细胞计数试剂盒8法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力，Transwell实验检测细胞的迁移能力，采用裸鼠皮下移植瘤实验检测En1对ESCC细胞体内肿瘤生长的影响。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞中En1及Hedgehog通路主要调控因子胶质瘤相关癌基因家族锌指1（GLI1）、GLI2和平滑蛋白（SMO）的表达。结果:来自TCGA数据库的泛癌样本资料显示，En1低表达患者的总生存时间和无进展生存时间均比En1高表达患者更长（均 P＜0.001）。来自GEO和NGDC-GSA数据库的资料显示，ESCC组织中En1的表达水平高于配对癌旁组织（均 P＜0.001）。功能研究显示，与shNC组相比，敲降En1能显著抑制KYSE180和KYSE450细胞的增殖（均 P＜0.001）、抑制克隆形成［KYSE180细胞：shEn1#1组和shEn1#2组的克隆形成数分别为（138.33±23.07）个和（127.00±19.70）个，均低于shNC组的（340.67±12.06）个（均 P＜0.001）；KYSE450细胞：shEn1#1组和shEn1#2组的克隆形成数分别为（65.33±2.52）个和（9.00±3.00）个，均低于shNC组的（139.00±13.00）个（均 P＜0.001）］、抑制迁移［KYSE180细胞：shEn1#1组和shEn1#2组的迁移细胞数分别为（66.67±12.66）和（71.33±11.02）个，均低于shNC组的（334.67±16.56）个（均 P＜0.001）；KYSE450细胞：shEn1#1组和shEn1#2组的迁移细胞数分别为（112.33±14.57）和（54.33±5.51）个，均低于shNC组的（253.33±21.03）个（均 P＜0.001）］。裸鼠皮下移植瘤实验显示，敲降En1肿瘤的生长速度减慢，shEn1#1组和shEn1#2组小鼠的移植瘤重量分别为（0.046±0.026）g和（0.047±0.025）g，均低于shNC组［（0.130±0.038）g，均 P＜0.001］。RT-qPCR检测结果显示，shEn1#1组和shEn1#2组KYSE180细胞中GLI1 mRNA表达量分别为0.326±0.162和0.322±0.133，shEn1#1组和shEn1#2组KYSE450细胞中GLI1 mRNA表达量分别为0.131±0.006和0.352±0.050，均低于shNC组（均 P＜0.01）。在敲降En1的KYSE450细胞中过表达GLI1，能减弱敲降En1对细胞增殖（ P＜0.001）、克隆形成［shEn1#1-GLI1组的克隆形成数为（151.00±9.54）个，高于shEn1#1-vector组的（102.33±10.02）个（ P=0.004）］和迁移［shEn1#1-GLI1组的迁移细胞数为（193.67±10.07）个，高于shEn1#1-vector组的（109.33±11.50）个（ P＜0.001）］的抑制作用。ESCC组织中GLI1、GLI2、GLI3、音猬因子、SMO和补缀同源物1的表达水平均高于配对癌旁组织，Hedgehog通路被激活。 结论:En1在ESCC组织中高表达，其通过调节Hedgehog信号通路在促进ESCC细胞增殖和迁移中发挥重要作用。

目的 探讨左归丸含药血清对成骨细胞中Hedgehog-GLi通路关键蛋白表达及破骨细胞数量的影响.方法 选用 50只雌性SD大鼠,随机分为空白对照组、假手术组、造模组.造模组大鼠切除双侧卵巢,12 周后随机分为卵巢切除组(ovariectomy,OVX)、阳性对照组和左归丸组.阳性对照组大鼠灌服戊酸雌二醇混悬液,左归丸组大鼠灌服左归丸水煎液,连续干预 7d.末次给药 1.5h后,腹主动脉取血制备各组相应含药血清.建立成骨细胞、破骨细胞、骨磨片共培养体系,分为空白对照血清组、假手术血清组、OVX血清组、阳性对照血清组、左归丸含药血清组、激动剂组和激动剂+左归丸含药血清组,分别添加各组对应血清.免疫荧光法检测成骨细胞印度刺猬蛋白(Indian hedgehog,Ihh)、碎片蛋白(patched,Ptch)、润滑蛋白(smoothened,Smo)及GLi1 蛋白表达;免疫组化法检测成骨细胞骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子受体激活因子-κB配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)蛋白表达;对破骨细胞进行TRAP染色,计算TRAP+细胞数;ELISA检测共培养体系上清液中TRAP的含量.结果 与假手术血清组比较,OVX血清组Ihh、Ptch、Smo、GLi1 蛋白表达水平显著上调(P<0.01),RANKL/OPG比值增高;TRAP+细胞数和细胞上清液中TRAP含量亦明显增加(P<0.05).与OVX血清组比较,左归丸含药血清组Ihh、Ptch、Smo、GLi1 的蛋白表达明显下调,RANKL/OPG比值下降;TRAP+细胞数和细胞上清液中TRAP含量明显降低(P<0.05).与激动剂组比较,加入左归丸含药血清后,Ihh、Ptch、Smo、GLi1 的蛋白表达及RANKL/OPG比值均明显下降,TRAP+细胞个数及 TRAP 含量亦明显降低(P<0.05).结论 左归丸含药血清可通过抑制异常活跃的Hedgehog-GLi信号通路,使Ihh、Ptch、Smo、GLi1 的蛋白表达水平下调,降低RANKL/OPG比值,抑制破骨细胞的数量和活性,起到减少骨丢失作用.

目的 探究微小RNA-92a(miR-92a)调控音猥因子(SHH)途径对心肌缺血再灌注(I/R)损伤后促血管再生的影响及机制.方法 从1～3 d龄SD大鼠中培养原代心肌细胞后建立心肌细胞缺氧/复氧模型,将其分成心肌细胞常氧培养组和心肌细胞I/R组.miR-92a模拟物(mimic)和拮抗剂(inhibitor)转染入大鼠原代心肌细胞,使miR-92a过表达或低表达,分成对照组、I/R组、miR-92a mimic组和miR-92a inhibitor组.细胞计数法8测 定各组细胞活力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,ELISA和QT-PCR测定血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管生成素1等血管新生因子表达,Western blot法测定SHH信号通路蛋白表达.结果 心肌细胞I/R组miR-92a表达显著高于心肌细胞常氧培养组(3.89±0.29 vs 1.53±0.19,P＜0.01).对照组、miR-92a inhibitor组、I/R 组和 miR-92a mimic 组 SHH 蛋白(0.57±0.13 vs 0.51±0.11 vs 0.24±0.03 vs 0.14±0.02,P＜0.01)、Smooth-ened 蛋白(0.53±0.12 vs 0.49±0.10 vs 0.14±0.04 vs 0.09±0.01,P＜0.01)、神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白 1(0.56±0.14 vs 0.50±0.13 vs 0.15±0.03 vs 0.08±0.01,P＜0.01)和神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白 2(0.58±0.11 vs 0.49±0.12 vs 0.18±0.02 vs 0.11±0.03,P＜0.01)比较差异有统计学意义.结论 miR-92a在心肌I/R损伤中异常高表达,抑制miR-92a表达可激活SHH信号通路有效促进血管再生因子表达.

In growing children,growth plate cartilage has limited self-repair ability upon fracture injury always leading to limb growth arrest.Interestingly,one type of fracture injuries within the growth plate achieve amazing self-healing,however,the mechanism is unclear.Using this type of fracture mouse model,we discovered the activation of Hedgehog(Hh)signaling in the injured growth plate,which could activate chondrocytes in growth plate and promote cartilage repair.Primary cilia are the central transduction mediator of Hh signaling.Notably,ciliary Hh-Smo-Gli signaling pathways were enriched in the growth plate during development.Moreover,chondrocytes in resting and proliferating zone were dynamically ciliated during growth plate repair.Furthermore,conditional deletion of the ciliary core gene Ift140 in cartilage disrupted cilia-mediated Hh signaling in growth plate.More importantly,activating ciliary Hh signaling by Smoothened agonist(SAG)significantly accelerated growth plate repair after injury.In sum,primary cilia mediate Hh signaling induced the activation of stem/progenitor chondrocytes and growth plate repair after fracture injury.

目的:研究miR-140-5p对口腔鳞状细胞癌(OSCC)增殖及凋亡的影响.方法:实时定量RT-PCR检测miR-140-5p在OSCC细胞系Tca8113、Cal27、SCC25中以及正常人口腔黏膜成纤维细胞系(hOMF)的表达;MTT法检测miR-140-5p mimic转染对Tca8113细胞增殖的影响;流式细胞仪检测miR-140-5p mimic转染对Tca8113细胞凋亡的影响;双荧光素酶报告基因检测miR-140-5p与微管解聚蛋白1(STMN1)的靶向关系;Western blot法检测hOMF和三种OSCC细胞中STMN1的表达,以及miR-140-5p mimic转染对Tca8113细胞中STMN1、音猬因子(Shh)、Smoothened(Smo)、Ptch、胶质母细胞瘤转录因子(Gli1)等的表达.结果:miR-140-5p在三种OSCC细胞系中的表达显著下调;过表达miR-140-5p可显著抑制Tca8113细胞增殖,促进细胞凋亡.双荧光素酶报告基因表明STMN1为miR-140-5p的靶向调节基因.STMN1在OSCC细胞中的表达显著上升,过表达miR-140-5p可显著抑制STMN1、Shh、Smo、Ptch、Gli1等的表达.结论:miR-140-5p可通过抑制STMN1的表达,抑制Hedgehog信号通路,来抑制OSCC细胞增殖,促进细胞凋亡.

目的 探讨胰岛素增强子结合蛋白(ISL-1)及音速波状蛋白(Sonic Hedgehog,Shh)信号通路分子在小鼠胚胎心流出道的早期表达特点与其发育的关系. 方法 取胚龄8-13d小鼠胚胎心脏40例制作连续石蜡切片,应用抗音速波状蛋白(Shh)、抗Smoothened (Smo)、抗Patched(Ptc1)、抗Patched 2 (Ptc2)、抗ISL-1、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光化学染色. 结果 胚龄8-9d,Shh阳性表达于前肠腹侧内胚层,Ptc1和Ptc2在心管心肌呈较强阳性表达,ISL-1阳性细胞自心包腔背侧壁、前肠两侧间充质延伸至心管动脉端.胚龄10-13 d,前肠内胚层向腹侧延伸形成喉气管沟,并呈Ptc1和Ptc2强阳性表达,ISL-1和Smo双阳性细胞围绕喉气管沟形成对称的锥体形结构,其顶端突入动脉囊腔,形成主肺动脉隔,随发育进行,主肺动脉隔由ISL-1阳性表达逐渐转为α-SMA强阳性表达,并将动脉囊分隔为MHC阴性的心包内升主动脉和肺动脉干. 结论 Shh信号通路与ISL-1阳性细胞共同参与小鼠胚胎心流出道的正常形态发生.

目的 采用携带Smoothened (SMO)基因靶向小干扰RNA(siRNA)的慢病毒表达载体转染胰腺癌细胞后体外观察其对细胞生物学特性的影响.方法 依据前期研究方法合成3条携带SMO siRNA慢病毒表达载体(滴度:5×108、6×108、5×108 TU/ml),分别转染Patu-8988细胞后采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测细胞中SMO基因的表达并计算基因表达抑制率;筛选抑制率最高干扰表达载体转染Patu-8988细胞72 h,采用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞生长情况、流式细胞仪检测细胞凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭转移能力、Western blot法检测通路靶基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)表达情况.结果 构建的3条SMO siRNA慢病毒表达载体对Patu-8988细胞SMO基因表达的抑制率分别为82.4％、93.1％及89.1％,选择抑制效率最高的干扰载体转染Patu-8988细胞72 h后,细胞生长状况良好;与阴性对照组比较,转染组Patu-8988细胞第1天至第5天细胞生长抑制率分别为(7.46±0.32)％、(25.41 ±0.28)％、(25.94±0.51)％、(26.01±0.94)％及(43.23±0.88)％.;细胞凋亡率为(1.35±0.11)％低于对照组但可视为未发生显著凋亡(t=-4.523,P=0.011);转染组侵袭小室与Transwell小室细胞数分别为(38.00±4.73)个/高倍视野与(78.00±3.71)个/高倍视野,明显低于对照组[(128.00±10.91)个/高倍视野与(306.00±9.12)个/高倍视野;t=-22.808,P=0.000;t-69.256,P=0.000];转染后细胞内bcl-2蛋白的相对表达量为0.24±0.01明显下调(t=-27.386,P=0.000).结论 SMO siRNA慢病毒表达载体可有效阻断Hedgehog信号通路并显著抑制Patu-8988细胞的生长及其侵袭转移能力.

目的 探讨经典Shh信号通路对小鼠胚胎肺发育过程中上皮、间质(支气管软骨、平滑肌)发育的调控作用.方法 利用免疫组化检测Shh通路受体Smo(Smoothened)以及血小板源性生长因子受体(Pdgfr-α)的表达;利用Pdgfr-α间质特异性表达的特点构建Pdgfr-α-cre,通过他莫昔芬的诱导,在E12.5-E16.5(E,embryo)天转基因小鼠肺间质中特异性敲除Shh关键信号分子Smo;利用免疫荧光观察E12.5-E16.5小鼠胚胎肺间质特异性敲除Shh信号通路之后,小鼠胚胎肺发育过程中上皮、间质(支气管软骨、平滑肌)发育的改变,探讨Shh信号通路在小鼠胚胎肺发育过程中对上皮-间质转化的作用.结果 Smo在假腺期早期的肺上皮与间质中显著表达,后表达量逐渐下调,主要集中在肺间质,Pdgfr-α在假腺期早期胚胎肺中集中在远端肺上皮及间质,后期逐渐往近端间质发展,直至集中在主支气管周围的近端间质;首次利用Pdgfr-α-Cre系统在间质中特异性敲除Smo,成功制备了Smo缺失小鼠模型;与对照组肺相比,E12.5-E16.5基因敲除组小鼠的肺体积缩小,支气管分支形成减少;近端上皮指标P63的表达量下降(P<0.05);平滑肌标志物表达水平发生改变;支气管软骨发育滞后,黏蛋白表达量下降.结论 Shh信号通路的时空特异表达在小鼠胚胎肺上皮、间质(支气管软骨、平滑肌)发育的起着重要的调控作用.

目的 探讨刺猬(hedgehog,Hh)信号通路在慢性氟中毒大鼠关节软骨损害中作用.方法 36只健康SD大鼠随机分为对照组(自来水含氟量＜1mg/L),低、高氟组(饮水含氟量分别为5、50 mg/L),每组12只.饲养6个月后,应用氟离子电极法检测各组大鼠尿氟、骨氟含量;苏木素-伊红(HE)染色观察关节软骨组织病理形态学改变;免疫组织化学(IHC)、蛋白印迹法(Wb)检测大鼠关节软骨组织中音速刺猬蛋白(Shh)、跨膜蛋白(Smo)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及B细胞淋巴瘤基因/白血病基因-2 (Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)蛋白表达情况.结果 与对照组比较,低、高氟组大鼠尿氟含量[分别为(3.66±0.43)、(8.05±0.60)mg/L]与骨氟含量[分别为(402.38土33.77)、(935.12±49.60)mg/kg]明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);染氟组大鼠后肢膝关节干骺端软骨厚度变薄,软骨细胞数减少,具有硬化性氟骨症改变;与对照组比较,低、高氟组大鼠关节软骨组织中Shh、Smo、BMP-2及Bax蛋白表达[分别为(0.86±0.09)、(0.92±0.11)、(1.02±0.14)、(0.91±0.14);(¨l±0.15)、(117土0.14)、(1.13土0.12)、(0.92±0.11)]均明显升高,Bcl-2蛋白表达[分别为(0.78±0.03)、(0.57±0.09)]明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Hh信号通路的激活及其下游靶基因过度表达,参与慢性氟中毒关节软骨损伤的发病过程.

目的:探讨胶质瘤相关癌基因2(Gli2)对高糖条件下的肾小管上皮细胞凋亡及活性氧(ROS)水平影响.方法:用肾小管上皮细胞NRK-52E为研究对象,分别转染Gli2过表达载体和对照载体,同时用不转染的细胞作为对照,RT-PCR和Western blot检测Gli2水平,用高糖和低糖细胞培养液培养不转染的对照细胞,同时以高糖培养液培养转染Gli2过表达载体的细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测ROS含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western blot检测 Bcl-2 相关 X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Ptch相关跨膜蛋白Smoothened(Smo)水平.结果:NRK-52E细胞转染Gli2过表达载体后的Gli2 mRNA和蛋白水平均明显高于对照细胞(P＜0. 01),而转染对照载体后的NRK-52E细胞中Gli2 mRNA和蛋白水平与对照细胞相比没有差异(P＞0. 05).高糖培养后的不做转染的NRK-52E细胞凋亡率升高,ROS含量升高,SOD含量下降,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3水平升高,Smo水平下降,与对照细胞相比差异具有统计学意义(P＜0. 01).而过表达Gli2后的 NRK-52E细胞经高糖培养后,细胞凋亡率下降,ROS含量降低,SOD含量升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3水平下降,Smo水平升高,与单纯高糖培养的NRK-52E细胞相比,差异具有统计学意义(P＜0. 01).结论:高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡和氧化损伤,Gli2可以降低高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡,减轻氧化损伤.