目的 构建人 Bcl2 拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒 pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响.方法 利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER -Bak1,通过基因测序鉴定载体序列.将重组载体PmeⅠ线性化、脱磷酸化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中进行基因同源重组.将重组腺病毒质粒pAD-Bak1经PacⅠ酶切线性化后,用Lipofectamine 2000脂质体转染到HEK-293细胞中进行包装扩繁,荧光定量PCR法测定病毒滴度.感染MG63细胞,qPCR和Western blot检测Bak1的表达,MTT检测细胞活性.结果 测序及酶切验证 pENTER-Bak1构建成功. pAD-Bak1 感染MG63 细胞,qPCR检测到细胞中Bak1基因过表达(与NC对照组和空白对照组相比P＜0.01、P＜0.01),Western blot检测到细胞中Bak1蛋白过表达. MTT检测显示与 NC对照组相比,细胞活性减弱(P＜0.05).结论 成功构建了Bak1重组表达腺病毒,验证了其能够感染MG63细胞表达Bak1蛋白,证明了过表达Bak1可以减弱细胞的活性.为进一步研究Bak1的功能奠定了基础.
作者：柴爽；黄红；万雷；王吉利；王伟；黄宏兴
来源：广东医学 2018 年 39卷 9期
