目的 克隆嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)锰超氧化物歧化酶(CtMnSOD)基因,进行毕赤酵母真核表达、纯化重组CtMnSOD蛋白,并分析其酶学性质.方法 提取嗜热毛壳菌总RNA,根据CtMnSOD基因全长编码序列(登录号为EF569987)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pPIC9K载体,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD经5acⅠ线性化后,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,并加入甲醇诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;重组CtMnSOD经硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化;并通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法测定酶学性质.结果 RT-PCR扩增产物约为684 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD构建成功.SDS-PAGE结果显示,经甲醇诱导获得约22.7 kDa的可溶性重组蛋白.酶活力分析结果表明,工程菌酶活力达906.23 U/ml;该重组酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0;在70℃的条件下保温30 min后仍具有71％的酶活力.结论 CtMnSOD在毕赤酵母中高效分泌表达,该酶具有较高的热稳定性,具有较好的工业应用价值.
作者：张丽青；咸洪泉；张庆乐
来源：环境与健康杂志 2015 年 32卷 5期
