目的 建立基于溶细胞毒素基因vvhA检测创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的TaqMan实时荧光定量PCR.方法 采用Primer Express软件,设计位于vvhA基因序列保守区的PCR引物和TaqMan探针,建立检测创伤弧菌vvhA基因100 bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR.采用基因克隆技术,构建作为阳性对照的pMD19-vvhA100重组质粒.以最低扩增循环数(Ct值)、荧光强度增加值(△Rn)为观察指标,对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR条件进行优化.以不同浓度的创伤弧菌及其它8种细菌DNA和pMD19-vvhA100为模板,对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性进行验证.创伤弧菌经腹腔和皮下注射及灌胃感染ICR小鼠,验证vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR对感染小鼠血液、皮下感染组织和肠内容物的检测效果.结果 所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或pMD19-vvhA100呈现阳性检测结果,其检测灵敏度可达0.01 ng创伤弧菌DNA或103个拷贝的pMD19-vvhA100,不同浓度pMD19-vvhA100三次检测结果的SD≤0.79,对腹腔和皮下感染创伤弧菌的小鼠血液、皮下组织标本检测结果均为阳性.结论 所建立的创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点,适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速

作者：吴增辉；楼永良；卢中秋；卢亦愚；严杰

来源：中华急诊医学杂志 2007 年 16卷 5期