[目的]克隆和表达小菜蛾Plutella xytostella氨肽酶基因,并进行基因序列分析和同源建模分析.[方法]以小菜蛾中肠cDNA为模板克隆分析氨肽酶基因序列,原核表达氨肽酶蛋白并进行酶活性测定,应用配体印迹分析氨肽酶与Cry2Ab蛋白的结合,通过蛋白质建模对突变位点进行分析.[结果]从小菜蛾中肠cDNA扩增出氨肽酶基因,该基因全长2 853 bp,编码950个氨基酸,预测蛋白分子量为107.3871 kDa,等电点为5.24;进化树分析显示,克隆得到的氨肽酶基因属于APN家族5,将其命名为PxAPN5(GenBank登录号:KM034756).PxAPN5蛋白具有鳞翅目昆虫氨肽酶蛋白的保守性特征,即含有N-糖基化位点、O-糖基化位点和GPI锚定位点,具有“HEXXH”锌蛋白酶结构域和C端跨膜区域.在大肠杆菌Escherichia coli中原核表达PxAPN5,表达产物经SDS-PAGE电泳,在110 kDa附近出现特异性条带;酶活性测试显示菌体破碎上清液具有氨肽酶活性,比活力为1 047.2 U/g.配体印迹结果显示表达的PxAPN5能与Cry2Ab蛋白特异性结合.多序列比对结果表明,与其他已报道的小菜蛾氨肽酶相比,PxAPN5氨基酸序列有3个保守性位点发生了突变,并通过蛋白质建模的方式表征突变位点.[结论]本研究成功克隆和表达了具有氨肽酶活性的小菜蛾氨肽酶,并发现其能与Cry2Ab蛋白特异性结合;通过蛋白质建
作者：许炼；高焕娟；潘志针；朱育菁；陈清西；刘波
来源：昆虫学报 2014 年 57卷 11期
