目的 建立靶向沉默诱骗受体3(decoy rcceptor 3,DcR3)基因表达的DcR3 RNAi-SW480稳转细胞系,并对其条件及方法进行优化.方法 构建靶向沉默DcR3基因的siRNA质粒表达载体,转染SW480细胞,并以G418及流式细胞仪筛选稳转细胞.实验分为3组:DcR3-RNAi稳转组、阴性对照组、空白对照组.蛋白质印记法(Western-blot)检测DcR3蛋白沉默情况.分别应用琼脂糖凝胶电泳、甲基噻唑基四唑(MTT)比色法、流式细胞术等方法对脂质体与质粒的比例、G418的筛选浓度、筛选的最佳方式等进行优化.结果 DcR3-RNAi稳转细胞组DcR3表达水平较对照组明显降低；在本实验室条件下,脂质体(μl)与DcR3-siRNA质粒(μg)最佳比例为3.5∶1；G418筛选浓度为800 mg/L;G418联合流式细胞仪双筛的稳转细胞比例明显高于仅用G418单筛.结论 成功建立特异性沉默DcR3基因表达的稳转DcR3-RNAi-SW480细胞系；G418联合流式是筛选稳转细胞较高效的方法；对转染及筛选的条件及方法进行优化,可提高转染与筛选效率.
作者：于玮；何平；陶莹；李洋；李晶；吴涛；伍冀湘；戴洁
来源：临床荟萃 2012 年 27卷 22期
