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IAA2(Indole Acetic Acid2)是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员,目前还没有它的突变体的报道,阻碍了对其功能和作用机制的深入研究.在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,1个sgRNA只能靶向基因的1个位点,有时基因敲除的效率并不高.为了提高敲除效率,本文在Golden-Gate克隆技术的基础上,通过两轮PCR扩增,将每3个sgRNA串联到同1个入门载体中,再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应,获得最终的表达载体.结果表明,设计的6个sgRNA有4个发挥了作用,产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变.与单个sgRNA相比,多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多;与其他构建多重sgRNA载体的方法相比,本方法具有快速、高效等优点.本文所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料.

作者:刘丁源;邱婷;丁晓辉;李苗苗;朱睦元;王君晖

来源:遗传 2016 年 38卷 8期

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作者:
刘丁源;邱婷;丁晓辉;李苗苗;朱睦元;王君晖
来源:
遗传 2016 年 38卷 8期
标签:
CRISPR/Cas9 多重sgRNA串联 基因组编辑 IAA2基因 CRISPR/Cas9 multiple sgRNAs genome editing IAA2
IAA2(Indole Acetic Acid2)是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员,目前还没有它的突变体的报道,阻碍了对其功能和作用机制的深入研究.在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,1个sgRNA只能靶向基因的1个位点,有时基因敲除的效率并不高.为了提高敲除效率,本文在Golden-Gate克隆技术的基础上,通过两轮PCR扩增,将每3个sgRNA串联到同1个入门载体中,再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应,获得最终的表达载体.结果表明,设计的6个sgRNA有4个发挥了作用,产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变.与单个sgRNA相比,多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多;与其他构建多重sgRNA载体的方法相比,本方法具有快速、高效等优点.本文所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料.