目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3；选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞；实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率；G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001)；TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.
作者：张建军；王博；田元；张景辉；吴河水
来源：中华胰腺病杂志 2012 年 12卷 3期
