目的 构建小鼠Cbl-b基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,并初步鉴定其干扰效果,为后续研究Cbl-b在黑素瘤免疫治疗中的作用奠定基础.方法 根据基因库提供的Cbl-b cDNA序列,设计并合成4对短发夹结构的互补DNA序列,克隆至载体PGPU6/GFP/Neo构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定.重组干扰质粒构建成功后,将干扰质粒与Cbl-b过表达载体共转染293T细胞,于转染后48 h,通过实时荧光定量PCR法及蛋白质印迹法检测各质粒对Cbl-b基因的表达抑制效应.结果 测序分析证实,4对shRNA寡核苷酸序列分别成功插入至shRNA真核表达载体PGPU6/GFP/Neo中,将构建成功的PGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒与Cbl-b真核表达载体共转染细胞48 h后,通过荧光实时定量PCR法及Western印迹测定,发现4条shRNA序列对Cbl-b的表达均有一定的抑制效应,其中以1号shRNA序列重组质粒对Cbl-b表达的抑制程度最高(P＜0.05).结论 成功构建并筛选出沉默效应最高的Cbl-b shRNA真核细胞表达载体.
作者：胡彬；倪娜娜；吕雅琳；陈浩；刘毅；孙建方
来源：中华皮肤科杂志 2015 年 48卷 3期
