目的：以 Tet-on 慢病毒为载体建立稳定表达 GJB6基因及其突变体的 HaCaT 细胞株，为后续研究有汗性外胚层发育不良的发病机制奠定实验基础。方法利用 PCR 技术扩增人 GJB6基因野生型与突变型（A88V）基因，重组 Tet-on 慢病毒质粒，经基因测序及酶切技术对其鉴定，再将重组慢病毒转染入 HaCaT 细胞，经嘌呤霉素筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白 Cx30的 GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素诱导后，通过 RT-PCR 检测 GJB6基因的 mRNA 表达量，同时通过 Western 印迹检测 Cx30与 FLAG 标签肽的表达，从而对稳定表达 GJB6基因的 HaCaT 细胞株进行鉴定。用 CCK8法检测 GJB6基因野生型与突变型经四环素诱导表达后对细胞增殖的影响。结果经酶切、测序鉴定，重组慢病毒质粒构建成功。RT-PCR 检测到稳定转染的 HaCaT 细胞中 GJB6基因 mRNA 表达量明显增加，感染野生型 Tet-on 慢病毒的 HaCaT 细胞组（WT 组）加四环素 GJB6基因表达丰度是 WT 组不加四环素的113.369倍（P ＜0.05），感染突变型（A88V）Tet-on 慢病毒的 HaCaT 细胞组（MU组）加四环素 GJB6基因表达丰度是 MU 组不加四环素的3.249倍（P ＜0.05）；Western 印迹可检测到经四环素处理的 WT 组和 MU 组稳定表达 Cx30与 FLAG，而未经四环素处理的细胞和感
作者：路雨婷；王震英；宋亚丽；姬灿灿；张莉
来源：中华皮肤科杂志 2016 年 49卷 4期
