目的 应用转基因技术体外培养稳定表达人内皮抑素的视网膜色素上皮(RPE)细胞,为脉络膜新生血管(CNV)基因治疗奠定基础.方法 采用人内皮抑素真核表达载体pSecTagA-h内皮抑素,应用电转移法及脂质体介导法转染Brown Norway(BN)大鼠RPE细胞,以平阳霉素筛选出表达内皮抑素的RPE细胞,传代培养3周.转染后提取RPE细胞总DNA,聚合酶链反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳,原位杂交,蛋白印记和免疫组织化学观察内皮抑素在转染RPE细胞中的表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染RPE细胞培养上清液中内皮抑素的表达水平;四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定所表达内皮抑素蛋白活性.结果 PCR检测结果表明转染后的RPE细胞总DNA中存在长度为550碱基对左右的特异性条带;原位杂交,免疫组织化学观察到大量RPE细胞表达内皮抑素mRNA及内皮抑素蛋白;蛋白印记显示,RPE细胞裂解产物中有内皮抑素阳性条带;ELISA法检测到转染后3、5、7、10、14、20 d6个时间点培养上清液内皮抑素蛋白表达量分别为(321.5±41.0)、(162.5±23.45)、(78±11.22)、(78±9.87)、(78±10.06)、(78±12.67)ng/ml;MTT显示,培养上清液中内皮抑素能够抑制脐静脉内皮细胞304的增生,IC50为45.68 μg/ml,对RPE细胞、K562的生长无影响.结论 经电转移法及脂质体介导转染法获
作者：尚庆丽；马景学；高健；白玉；宋欣；朱京童
来源：中华眼底病杂志 2007 年 23卷 1期
